Pemeriksaan Mikroskopik Cepat Untuk Negri Bodies Dan Persiapan Spesimen Untuk Tes Biologis

Virus rabies menimbulkan timbulnya inklusi bodi yang spesifik, yang dikenal dengan  Negri bodies, dalam sitoplasma sel syaraf atau sel kultur yang terinfeksi. Inklusi bodies ini ini sanggup dideteksi  secara histopatologis dengan mikroskop atau dengan flourscent antibodi (FA) test.

Mikroskop FAT. investigasi FAT diruang gelap (sumber : http://www.who-rabies-bulletin.org/about_rabies/Diagnosis.aspx)

Positif Rabies ; Negri Bodies yang berpendar dalam investigasi FAT. (sumber : http://www.who-rabies-bulletin.org/about_rabies/Diagnosis.aspx)

Teknik pengerjaan dalam laboraatorium diagnosis rabies sebaiknya dilakukan dalam kondisi yang optimum menyangkut kekakuratan, ketepatan, kecepatan, dan ekonomi. Metode pengerjaan investigasi mikroskopis untuk Negri bodies dalam kesempatan ini, memakai aplikasi pengerjaan jaringan otak sederhana pada beling preparat dan pewarnaan Seller.

Diseksi (pemotongan) jaringan otak

Prosedur pemotongan sederhana diharapkan untuk menemukan tanduk ammon (ammon’s horn) yang merupakan area terbaik untuk menemukan negri bodies pada binatang yang terkena rabies. 

Dengan gunting steril, lakukan incise longitudinal di area dorsal tiap potongan hemisphere cerebral, yaitu sekitar 2 cm dari fissure longitudinal atau areal midline dari otak.

Insisi dibentuk dari region occipital dari hemisphere dan memanjang sekitar 3-5 cm dan menembus ke bawah melalui gray matter, kemudian white matter hingga menemui sebuah rongga, yang menadakan wilayah ventrikel lateral dicapai. 

Ilustrasi ammon horn. ammon horn mempunyai suatu tempat yang berjulukan hippokampus, yang merupakan area utama dalam investigasi rabies.

Ammon horn, dalam incisi permukaan dorsal otak

Pembukaan kemudian diperluas dengan menginsisi hemisphere otak, dan tanduk Ammon’s (ammon’s horn) akan tampak dalam bentuk semi-silinder, putih, lebih mengkilap dari potongan ventikel, dan konturnya spiral.

Persiapan preparat

Preparat sebaiknya dibentuk dari tanduk ammon’s (ammon’s horn) pertama potongan kortek dan balasannya dari potongan cerebellum. Jaringan sampel (sekurang-kurangnya enam) sebaiknya diambil masing-masing 3 dari area tadi tiap preparatnya dan diperiksa secara mikroskopis sebelum balasannya otak dilaporkan negatif atau positif rabies. 

Dan lebih baik lagi untuk menentukan potongan dari hippocampus untuk mendapatkan hasil yang lebih baik.
 

Sebagai catatan, jaringan otak yang digunakan sebaiknya dalam keadaan masih segar untuk hasil yang lebih baik.

Metode impressi

Dengan sepasang gunting, potong kecil potongan jaringan otak (tanduk ammon’s, cerebrum, atau cerebellum) secara transversal (setebal 2-3 mm) dan tempatkan jaringan tersebut pada kertang pengering atau tissue yang higienis atau dengan kayu pegangan es krim, potong potongan yang menghadap ke atas. 

Ambil Kaca preparat kemudian sentuhkan  pada potongan permukaan yang terpotong ytadi dan tekan pelan-pelan dengan tekanan secukupnya untuk menciptakan penyebaran setipisnya dari jaringan otak. Sesuai dengan ukuran tadi, 3-4 impressi sanggup dibentuk pada satu beling preparat. 

Metode impressi

Ketika masih basah, beling preparat dicelupkan kedalam pewarnaan seller beberapa detik (1-5 detik), basuh dengan air mengalir, dan keringkan dalam suhu ruangan. Preparat siap untuk diperiksa.  

Metode impresi ini sanggup diperika secara eksklusif dengan oil emersi atau dengan cove glass yang dimounting dengan etellan. Metode ini lebih disukai dari metode lain lantaran jaringan saraf sanggup diperiksa semaksimal mungkin dengan kerusakan seluler yang minimal.

Metode Smear

Metode smear ini dilakukan dengan menempatkan potongan otak sekecil mungkin di potongan ujung beling preparat. Lalu ujung beling preparat yang lain ditempatkan secara vetikal di atas jaringan otak dengan sudut 450, kemudian digesekan satu arah sepanjang beling preparat pertama.  

Hasilnya ialah lapisan tipis jaringan otak yang homogeny yang sanggup dibagi menjadi tiga bagian. Pada teknik ini jaringan akan tersebar pada potongan selesai daripada potongan yang pertama (tebal). Metode ini harus dilakukan hati-hati semoga tidak menghasilkan lapisaan jaringan yang tebal, yang menciptakan pewarnaan dan investigasi mikroskopis sulit dilakukan.

metode smear (ulas)

Metode Rolling

Metode terakhir ialah teknik rolling, dilakukan dengan memotong potongan jaringan otak dengan diameter 5 mm, dan digulung di atas beling preparat perlahan-lahan dengan tusuk gigi. 

Pewarnaan seller direkomendasikan disini lantaran keakuratan dan kesederhaannnya. Pada teknik ini, tidak ada fiksasi, dan lapisan jaringan sanggup dihasilkan dan diwarnai secara serentak, menciptakan teknik ini menjadi teknik yang paling cepat dan gampang ditangani.

Negri body : diagnosis differensial

Meskipun secara umum bentuknya bulat, negri body sanggup ditemukan dalam banyak sekali bentuk. Dalam waktu bervariasi di laboratorium yang berbeda telah ditemukan negri body berbentuk bulat, oval, spheroid, amuboid, triangular, dan sebagainya. 

Dari segi ukuranpun bentuknya juga mempunyai banyak variasi, umumnya ditemukan berukuran 0,24 hingga 27,0 µm. Ditandai dengan sifat asidofilik dalam reaksi pewarnaan, dan mengambil warna pink hingga merah magenta (merah keunguan) pada pewarnaan diferensial yang memakai basic fuchsin atau eosin dengan methylen blue sebagai dasar.
 

Negri body ditemukan di dalam sitoplasma sel neuron, khususnya diantara nukleus dan sudut dari sel neuron, atau potongan memanjang dari tubuh sel. Karakteristik utana negri body ialah struktur internalnya. 

Matrik negri body bersifat asidofilik dalam reaksi pewarnaan, dan berisi struktur merah magenta pada potongan kecil dalam badanya, basofilik granul bewarna biru gelap hingga hitam. 

Ukuran granul tersebut umunya bervariasi mulai dari 0,2-0,5 µm. Granul yang lebih besar teletak di tengah sel, dan granul yang lebih kecil berkumpul disekitar tepi sel Negri body. Namun sayangnya granul-granul ini sangat sulit untuk dilihat.
 

Dalam akad universal, bahwa negri body digunakan sebagai diagnosis spesifik rabies, dan kehadirannya selalau mengindikasikan adanya jerawat pada binatang terkena. Selain itu, bentuk utuh dari negri body tidak sanggup dikelirukan dengan bentukan inklusi body yang lain. 

Namun, beberapa tipe tubuh inklusi lain terkadang sanggup ditemukan pada otak binatang yang sedang didiagnosis, dan lantaran kesamaannya, balasannya sanggup dikelirukan dengan Negri body. 

Contohnya, sifat asidofilik inklusi body dari canine distemper atau Rubarth disease (canine infectious hepatitis, fox encephalitis) terkadang menyerang otak anjing dan rubah liar. Bentukan inklusi ini  sering ditemukan pada potongan thalamus, dan lentiform nukleus daripada hipocampus. 

Dalam kasus yang sama, otak kucing yang tidak terkena rabies dan mencit laboratoris terkadang mengandung tubuh inklusi asidofilik yang non-spesifik dikala sedang menjalankan diagnosis rabies. 

Semua bentuk inklusi body non-spesifik ini juga sanggup tewarnai dalam pewarnaan Seller, namun tubuh inklusi non-spesifik ini, sanggup dibedakan dengan Negri body dalam pewarnaan Seller. Berikut karakteristik yang sanggup digunakan sebagai pembanding:

Badan inklusi intrasitoplasmik atipikal terkadang ditemukan pada binatang yang dibunuh dalam tahap awal rabies. Untuk hal ini, disarankan untuk menahan anjing yang dicurigai rabies untuk dikarantinakan, daripada dibunuh secepatnya, dan otaknya dikirim ke laboratorium untuk didiagnosis. 

Ada dua hal penting di sini. Pertama, memungkinkan sanggup dilakukan observasi untuk simptom-simptom yang berkaitan dengan rabies, yang sanggup digunakan untuk menciptakan diagnosis klinis penyakit. 

Kedua, semakin usang binatang tersebut hidup, semakin besar kesempatan untuk mendapatkan hasil positif dalam diagnosis mikroskopis. Lama waktu sakit secara klinis secara eksklusif berafiliasi dengan ukuran, dan pembentukan, Negri bodies.

Tes inokulasi pada mencit

Sejak negri body tidak selalu sanggup ditemukan pada otak binatang rabies yang mati. Maka penting untuk spesimen yang diduga negatif untuk dites ulang dengan inokulasi pada hewan. Suatu survei telah dilakukan dalam kasus rabies yang besar, mengambarkan 10-15% kasus yang dipastikan positif dengan inokulasi pada tikus ternyata meleset dengan investigasi mikroskopis dengan metode smear. 

Sehingga ini sangat direkomendasikan bahwa laboratorium sebaiknya dilengkapi dengan peralatan yang mumpuni untuk pelayanan diagnosis untuk menindaklanjuti tes inukulasi pada binatang pada jaringan otak binatang yang diduga negatif rabies, misalnya menyerupai Flourscent antibody test (FAT).

inokulasi mencit umur 2-3 minggu

 

Di masa lalu, marmut dan kelinci dipilih sebagai binatang uji yang paling cocok untuk tujuan diagnosis. Namun, semenjak injeksi intraserebral telah diperkenalkan pada mencit atau tikus putih yang menghasilkan jerawat konstan spesifik, maka mencit kini dipilih sebagai binatang uji yang utama. 

Hal ini dikarenakan, mencit membutuhkan biaya yang rendah, memungkinkan untuk memakai beberapa binatang dalam satu spesimen, masa inkubasi yang relatif pendek, dan konsisten menghasilkan negri body pada binatang yang telah diinokulasi dengan injeksi intraserebral. Mencit yang masih menyusui (kurang dari 3 hari) lebih gampang atau rentan mendapatkan rabies daripada mencit yang lebih tua.

Agen antimikrobial untuk kontaminasi dan dekomposisi spesimen

Sering sulit sekali untuk mendapatkan binatang di lapangan yang otaknya masih dalam keadaan steril bakteriologis. 

Kepala binatang mungkin sudah dikirim dalam waktu yang alama, atau binatang diambil sehabis jangka janjkematian yang cukup lama, ditembak, atau dipukul kepalanya denganbenda tumpul. Dan  Juga, janjkematian sanggup disebabkan oleh encephalitis bacterial.

Injeksi intraserebral kuman menimbulkan janjkematian mencit yang telah diinokulasi dalam waktu 1-3  hari atau lebih, sebelum virus rabies muncul pada inokulum yang mempunyai jangka periode inkubasi yang cukup. 

Di kondisi yang lain, mencit sanggup hidup lebih usang hingga masa periode inkubasi rabiesnya tercapai sempurna, dan mengambarkan symptom spesifik rabies sperti tremor, paralysis, dan prostrasi, diikuti kematian, dan mengambarkan negri bodies spesifik dan banyak kuman pada investigasi otak.
 

Ketika suatu sampel dicurigai mengalami kontaminasi kuman menyerupai otak binatang telah mengalami dekomposisi, penanganan terbaik ialah menunjukkan biro antimikroba pada suspensi otak sebelum meningokulasikannya pada mencit. 

1. Penicilin dan streptomysin akan menunjukkan hasil yang terbaik. Jika kedua gen ini tidak ada, sanggup memakai biro antimikroba yang lain.Penicillin dan streptomysin. Tambahkan 500 IU sodium benzylpenicillin dan 2 mg (1560 IU) streptomysin per ml suspensi jaringan. Biarkan dulu selama 30 menit pada suhu ruang sebelum diinjeksikan. Dosis ini biasanya cukup, namun untuk kontaminasi berat gunakan sebanyak 1000 IU penicillin dan 3 mg (2340 IU) streptomisin. 
2. Gliserol. Simpan specimen otak dalam gliserol murni selama 48 jam 
3. Phenol 0,5 %. Buatlah 0,5 % phenol dalam larutan garam fisiologis. Agen ini digunakan sebagai diluents untuk menciptakan 10 % jaringan inokulum. Simpan selama 6 jam atau sepanjang malam. Jika sudah disimpan selama 6 jam dalam temperature ruangan. Jika lebih dari 6 jam simpan suspensi sepanjang malam dalam refrigerator.
4. Thiomersal 1 : 5000. 1 : 5000 thiomersal dalam larutan garam fisiologis. Agen ini digunakan sebagai diluents untuk menciptakan 10 % jaringan inokulum. Simpan selama 6 jam atau sepanjang malam. Jika sudah disimpan selama 6 jam dalam temperature ruangan. Jika lebih dari 6 jam simpan suspensi sepanjang malam dalam refrigerator
   

Untuk menentukan ada tidaknya kontaminasi bakteri, sebagian jaringan emulsi sebaiknya dikultur pada dextrose infusion broth atau media serupa, dan di goreskan pada media blood agar. Jumlah yang direkomendasikan sekitar 0,1 ml emulsi dalam 3 ml media encer (broth). Media sebaiknya diinkubasi dalam satu malam pada suhu 37,5 derajat C.

Persiapan Perwarnaan Seller’s

Dalam Perwarnaan seller’s, Negri’s body dibedakan dengan warna merah magenta (heliotrop) hingga merah cerah, dengan potongan dalam bewarna biru gelap atau basofilik gelap. Seluruh potongan sel syaraf akan bewarna biru dan jaringan intertisial bewarna pink. Eritrosit akan bewarna merah copper dan sanggup dengan gampang dibedakan merah magenta-merah cerah dari negri body.

Negri bodies dalam pewarnaan Seller's. Berwarna Merah Magenta dan ada Granula Berwarna Biru

Negri bodies dalam pewarnaan seller's. (sumber : http://www.gettyimages.com/detail/photo/sellers-stain-light-micrograph-of-negri-high-res-stock-photography/128616019)

Negri bodies dalam pewarnaan Seller's. warna merah oblong

Bahan menciptakan pewarnaan :   
1.    Methylen blue.........................................................................................    10 gr
       Methanol (absolute aceton free).................................................................1000 ml

Dua materi diatas dicampur dalam satu wadah
2.    Basic fuchsin............................................................................................    5 gr
       Methanol (absolute aceton free)..................................................................500 ml
 

Dua materi diatas dicampur dalam satu wadah

Larutan yang sudah dicampur tadi disimpan didalam botol yang sanggup mencegah penguapan larutan (seperti botol dengan tutup yang diputar). Larutan juga sebaiknya mengandung tidak kurang dari 85% methylen blue, dan tidak kurang dari 92% basic fuchsin. 

Jika methanol adikara aceton free tidak ada, sanggup memakai Methanol murni (chemical pure).

Larutan pewarna
Methylen blue (larutan nomor 1).....................................................................2 bagian
Basic fuchsin (larutan nomor 2)......................................................................1 bagian
 

Campurkan seluruhnya larutan diatas, tapi jangan disaring. Simpan dalam wadah yang sanggup mencegah terjadinya penguapan. Larutan pewarna sebaiknya didiamkan terlebih dahulu selama 24 jam sebelum digunakan dan sehabis itu sanggup disimpan tanpa batas waktu, selama larutan tersebut tidak mengalami evaporasi.

Pengaturan pewarna

Ketika larutan pewarna telah dipersiapkan dengan baik dan akurat, proporsi di atas akan menghasilkan warna yang diharapkan sebagai pembeda. 

Namun, disarankan untuk menciptakan warna percobaan, dan jikalau hasil yang didapatkan tidak sesuai dengan warna normal, maka warna siap untuk diatur kembali. 

Jika potongan stroma bewarna merah cerah daripada merah mawar atau pink pada area yang lebih tipis, dan seluruh dampak warna cenderung kemerahan, artinya fuchsin terlalu dominan. 

Tambahkan cadangan larutan methylen blue di atas dalam jumlah yang sudah ditentukan/ditakar, cek kembali dengan pewarna percobaan tiap penambahan larutan hingga balance warna sesuai dengan yang diharapkan.

Ketika methylen blue terlalu dominan, Negri body akan berwarna merah maroon gelap dan sel syaraf cenderung lebih gelap. Dalam hal ini, tambahkan fuchsin secukupnya.

Prosedur pewarnaan

1. Preparat disentuhkan ke sampel otak, kemudian tipiskan lagi dengan menyentuhkan hasil sentuhan tadi ke tissue. Di sini fiksasi tidak perlu dilakukan. 
2. Ketika preparat masih dalam keadaan lembab, sesegera mungkin celupkan preparat tadi ke larutan pewarna selama 1-5 detik, tergantung pada ketebalan dari hasil sentuhan otak. 
3. Bilas dengan air mengalir, dan keringkan.
   

Dibeberapa wilayah air keran tidak menunjukkan hasil yang memuaskan untuk pembilasan. Kecocokan air ini sanggup ditentukan dengan membandingkan pembilasan preparat dengan air keran dengan pembilasan lain memakai air detilasi yang mengandung 0,66 mol/l phosphat buffer, pH 7.0.

Ketika tidak digunakan, larutan pewarna harus disimpan didalam kontainer yang tertutup rapat untuk mencegah evaporasi, yang sanggup menjadikan fuchsin menjadi terlalu dominan. 

Hasil terbaik didapatkan dikala jaringan otak masih segar. Dan jikalau jaringan otak telah mengalami dekomposisi, hal ini akan menghipnotis karakteristik diferensiasi warna, meskipun kualitas warna negri body tetap bertahan, seluruh jaringan preparat sentuh akan menjadi lebih merah atau terlalu biru, sehingga identifikasi negri body akan jauh lebih sulit.

Daftar pustaka

Meslin FX, Kaplan MM, Koprowski H. 1996. Laboratory techniques in rabies. World Health Organozation. Genewa

Share this post